pengeluaran β-nicotinamide mononucleotide (NMN) dalam Escherichia coli

Abstrak

Diabetes adalah penyakit kronik dan progresif dengan peningkatan kelaziman yang semakin meningkat, tekanan kewangan yang semakin meningkat terhadap sistem penjagaan kesihatan di seluruh dunia. Baru-baru ini, rintangan insulin, ciri khas diabetes jenis 2, telah sembuh pada tikus yang dirawat dengan NAD ⁺ prekursor β-nicotinamide mononucleotide (NMN) , tiada kesan toksik dilaporkan. Walau bagaimanapun, NMN mempunyai tag harga yang tinggi, lebih banyak kaedah pengeluaran kos efektif diperlukan. Kajian ini mencadangkan kaedah pengeluaran NMN bioteknologi dalam Escherichia coli . Kami menunjukkan bahawa ekspresi bicistronik sintetik nicotinamide phosphoribosyl transferase (Nampt) dan phosphoribosyl pyrophosphate (PRPP) sintetik dalam kehadiran nicotinamide (NAM) dan laktosa mungkin merupakan strategi yang berjaya untuk pengeluaran NMN berkesan kos. Vektor berkhasiat protein yang membawa gen NAMPT dari Haemophilus ducreyi dan synthetase PRPP dari Bacillus amyloliquefaciens dengan mutasi L135I ditukar dalam Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Pengeluaran NMN mencapai maksimum 15.42 mg setiap L budaya bakteria (atau 17.26 mg setiap gram protein) di sel-sel ini yang ditanam dalam medium PYA8 ditambah dengan 0.1% NAM dan 1% laktosa.

Pengenalan

Menurut Persekutuan Diabetes Antarabangsa, jumlah orang dewasa dengan diabetes jenis 2 adalah 425 juta pada tahun 2017, dan dijangka mencecah 649 juta menjelang 2045. Pada skala global, 12% daripada bajet penjagaan kesihatan (atau $ 727 bilion) sedang dibelanjakan pada merawat diabetes. Kajian baru-baru ini berkaitan rintangan insulin, ciri penyakit diabetes jenis 2, kepada penurunan fungsi mitokondria dan menurunkan tahap NAD ⁺ serta nisbah NAD ⁺ / NADH, juga diperhatikan dalam penuaan. NAD ⁺ hadir dalam semua organisma hidup dan merupakan koenzim yang terkenal dalam tindak balas pengurangan pengoksidaan. Deacetylases protein yang bergantung kepada NAD ⁺ seperti SIRT1 dan SIRT6 berfungsi sebagai sensor metabolik, dan mengawal saluran hiliran, yang akhirnya memulihkan fungsi mitokondria dan kepekaan insulin. Penemuan ini memanjangkan domain penyelidikan kesan NAD ⁺ kepada penyakit degeneratif lain yang berkaitan dengan penuaan, seperti: kardiovaskular, kanser, arthritis, osteoporosis atau penyakit Alzheimer.

Mononucleotide β-nicotinamide (NMN) adalah perantaraan dalam NAD ⁺ biosynthesis yang dihasilkan dari nikotinamida (NAM) dan fosforibosil piroposfat (PRPP) oleh enzim nikotinamide fosforibaseil (Nampt) (EC 2.4.2.12). Diluluskan dengan baik, tanpa kesan sampingan yang dilaporkan dalam pentadbiran jangka panjang dalam tikus, dan mencegah penurunan fisiologi yang berkaitan dengan usia, NMN terbukti berkesan dalam mengubati diabetes jenis 2 yang disebabkan oleh diet yang tinggi lemak, dengan membalikkan disfungsi mitokondria yang berkaitan dengan penuaan, dan menyelamatkan kesan penurunan umur yang berkaitan dengan sel induk saraf.

NAM biasanya ditukar kepada NMN oleh enzim yang terlibat dalam laluan NAD ⁺ salvage, seperti Nampt. Tindakan enzim ini merupakan aktiviti anabolic NAD utama dalam sel. Peraturan mamalia atau mikroorganisma metabolisme nukleotida dan biosintesis biasanya diteruskan dengan penggunaan PRPP. Keputusan PRPP dari ribose-5-fosfat melalui kedua-dua cabang oksidatif dan bukan oksidatif laluan pentos fosfat.

Dalam bakteria, NAM paling sering ditukar kepada asid nikotinik (NA) oleh nikotinamidase, yang disepadukan dalam laluan Preiss-Handler, ini juga merupakan kes Escherichia col . Dalam mamalia, aktiviti nikotinamidase tidak dilaporkan; NAM ditukarkan kepada NMN oleh salah satu enzim pemindahan fosforibase NAM. Walaupun kebanyakan bakteria tidak mempunyai pemindahan fosforibosil NAM, enzim ini dinyatakan dalam Haemophilus ducreyi dan Shewanella oneidensis .

Organisme mudah dan metabolik yang serba boleh, seperti Escherichia coli , sering digunakan dalam bioteknologi untuk mengekspresikan protein protein dengan aktiviti enzim yang dikehendaki. Pengekodan DNA untuk enzim semacam ini sering diperkenalkan dalam bakteria oleh vektor ungkapan seperti sistem pET dari Novagen. Vektor pET diubah dalam bakteria yang menyatakan polimerase RNA T7, seperti E. coli BL21 (DE3). Kawalan ekspresi enzim dicapai dengan menggunakan promoter lac , yang menghidupkan ungkapan hanya dengan kehadiran laktosa (juga dimetabolisme sebagai sumber karbon) atau analog struktur sintetik, Isopropyl-1-Thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) tidak dimetabolismekan, dengan tumpuan berterusan semasa proses pertumbuhan). Oleh kerana metabolisme bakteria adalah serba boleh, variasi sumber karbon dan kepekatan substrat enzim ditambah sederhana adalah faktor utama untuk diambil kira dalam proses bioteknologi.

Bertujuan untuk menangani masalah harga tinggi semasa NMN , dalam kerja terdahulu kami mencadangkan kaedah penulenan dari sel-sel bakteria. Untuk pengoptimuman proses selanjutnya, kerana kami dapat menemui hanya satu kaedah pengeluaran yis yang diterbitkan, kajian ini mencadangkan kaedah pengeluaran bioteknologi NMN yang mudah dan kos efektif di Escherichia coli .

Keputusan

Transformasi bakteria

Susunan jujukan asid amino berganda untuk NadV putative dari Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 dan Nampt dari Mus musculus , menunjukkan persamaan tinggi (Rajah S1), menjadikan semua enzim ini sebagai proses bioteknologi.

Perubahan E. sel coli dengan nadV (NAMPT) yang dibawa oleh pET28a (+) plasmid membentuk koloni pada plat LB Agar ditambah dengan kanamisin. Tiada koloni yang dikesan pada piring yang disuntik dengan sel bakteria yang tidak diterjemahkan. Elektroforesis gel agarose DNA plasmid yang diasingkan dari koloni ini mengesahkan kehadiran plasmid Nampt-PET28a, pET28a-soNadV atau pET28a-hdNadV di E. coli DH5α (Tambahan Rajah S2A, lorong 2, 3, 4). Band DNA sepadan dengan band dari E. sel-sel pLysS coli BL21 (DE3) (Supplementary Fig. S2A, lane 6, 7, 8), yang telah diubah dengan plasmid yang sama diekstrak terus dari E. coli DH5α. Dalam tidak diterjemahkan E. Coli BL21 (DE3) sel-sel pLysS, digunakan sebagai kawalan negatif, kehadiran plasmid pLysS disahkan oleh elektroforesis, sebuah band yang sepadan dengan panjang yang diketahui 4886 bp (Supplementary Fig. S2A, lane 5) ditunjukkan pada gel agarosa.

(Untuk data lebih eksperimen, lihat laman web asal: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)